تحقیق رایگان درباره پيلي، نوترکيب، باکتري

دسامبر 29, 2018 0 By mitra7--javid
پایان نامه  

ج حاصل از تعيين توالي ژنهاي هيبريد در پلاسميدهاي نوترکيبpEYS38cbm1, pEYS79cbm1 ,pEYS66cbm1, pEYS66cb?m1, pEYS92cb?m1 pEYS92cbm1, pEYS79cb?m1, pEYS38cb?m1, pEYS107cbm1, pEYS107cbm1 در پيوست هفت آورده شده است.

3-2-3 کلونينگ ژنهايcstH::cbm و cstH::cb?m در اپرون cst
جهت بيان و ارائه موتيفهاي اتصالي به کادميوم در سطح باکتريE .coli مي¬بايست ژنهايcstH::Cbm و cstH::Cb?m در اپرون کامل کدکننده پيلي CS3 قرار گيرند. شکل شماتيک 3-21 مراحل و نحوه کلونينگ ژنهاي هيبريدcstH::cbm و cstH::cb?m در اپرون پيلي را نشان ميدهد. براي انجام مراحل کلونيگ ترسيم شده در شکل 3-21، ابتدا باکتري داراي پلاسميد pPM4567 حاوي اپرون کامل پيلي Cs3 در محيط LB حاوي کلرامفنيکل کشت دادهشد و DNA پلاسميد آن توسط کيت استخراج پلاسميد، استخراج گرديد. سپس DNA پلاسميدي ابتدا با آنزيم AocI بريده شد و پس از حصول اطمينان از برش آن که از طريق الکتروفورز بر روي ژلآگارز حاصل شد، محصول برش آنزيمي فوق از روي ژلآگارز بازيافت شده وتوسط آنزيم BamH1 نيز بريدهشد. با برش توسط اين دو آنزيم، اپرون پيلي بدون زيرواحد CstH جدا ميگردد که اندازه تقريبي آن 43000bp مي¬باشد. محصول برش آنزيمي بر روي ژلآگارز يک درصد الکتروفورز گرديد، همانطور که در شکل 3-22 مشاهده ميشود در اثر برش آنزيمهاي BamH1 و AocI بر روي پلاسميد pPM4567 سه قطعه 2200~ ، 1700~ و 4295 ايجاد ميشود که قطعه 4295 حاوي اپرون از روي ژل جدا و خالص شد. سپس کلونهاي حاوي پلاسميدهاي نوترکيبpEYS38cbm1 ,pEYS79cbm1) ,pEYS66cbm1 ,pEYS66cb?m1 ,pEYS92cb?m1 ,pEYS92cbm1 ,pEYS79cb?m1 , pEYS38cb?m1, pEYS107cbm1 ,pEYS107cbm1) هريک بطور جداگانه در محيط L.B حاوي آمپيسيلين کشت دادهشد و پس از استخراج پلاسميد آن، توسط دو آنزيم AocI و BamHI بريدهشد. با اين برش قطعهاي با طولbp 396 خارج ميگردد و قطعه بزرگتر براي مرحله بعد از ژل جدا و خالص شد(شکل3-22). پس از خالص سازي DNA از ژلآگارز، اپرون پيلي (قطعه 4Kb) حاصل از برش آنزيمهاي AocI و BamHI پلاسميد pPM4567 (شکل3-22) به کمک آنزيم T4 DNA ligase به جايگاه AocI و BamHI پلاسميدهاي فوق متصل شد. محصول اتصال (Ligation) به داخل باکتري مستعدE. coli سويه DH5? منتقل شد. پلاسميد نوترکيب جديد به ترتيب pEYScbm2 و pEYScb?m2 نامگذاري گرديد.

شکل3- 21. شکل شماتيک کلونينگ ژن هيبريد cstH::cbm و cstH::cbbm در اپرون پيلي CS3.

شکل3-22. برش آنزيمي پلاسميد pPM4567 و پلاسميدهاي نوترکيب. برش آنزيمي DNA پلاسميد pPM4567 (حامل اپرون کامل cst) و پلاسميدهاي pEYSm1 و pEYSbm1 (نام دقيق,pEYSm1 pEYScbm1 و نام دقيق pEYSbm1 pEYScb?m1, ميباشد) (حامل ژنهاي جهشيافته به ترتيب cstH::cbm و cstH::cb?m) با دو آنزيم BamH1 و AocI و الکتروفورز آن بر روي ژلآگارز يک درصد. باندهاي مشخص شده باندهاي بودند که از روي ژل بازيافت شدند. از مارکر DNA100bp استفاده شد.

1-3-2-3 غربال کردن کلون هاي حاوي اپرون هيبريد cst::cbm و cst::cbbm
باکتريهاي دريافت کننده محصول واکنش اتصال حاوي پلاسميد نوترکيب در محيط LB حاوي آمپيسيلين کشت داده شد. DNA پلاسميدي به روش ليز قليايي استخراج گرديد و همراه با پلاسميدهاي فاقد پيلي (کنترل) بر روي ژل آگارز يک درصد الکتروفورز گرديد. DNAپلاسميدي کلونهاي نوترکيب که قطعه DNA ژنهاي کمکي اپرون cst را دريافت کرده بودند، وزن ملکولي بالاتري نسبت به DNA حاوي پلاسميد pEYScbm1 و pEYScb?m1 داشتند (شکل 3-23).

(A)

(B)
شکل 3-23 . الکتروفورز DNA پلاسميد هاي نوترکيب pEYScbm2 و pEYScb?m2 (حامل ژنهاي هيبريد cstH::cbm و cstH::cb?m) روي ژل آگارز يک درصد.(A) چاهک هاي ستاره دار پلاسميد pEYScbm1 ميباشند و به عنوان کنترل استفاده شدند، بقيه چاهک ها نمونه هاي دارنده اپرون نوترکيب مي¬باشند. (B) چاهک هاي ستاره دار پلاسميد pEYScb?m1 مي¬باشند و به عنوان کنترل استفاده شدند، بقيه چاهک ها نمونه هاي دارنده اپرون نوترکيب مي¬باشند.

1-1-3-2-3 تائيد صحت کلونينگ با برش آنزيمي
براي تائيد کلونينگ، DNA پلاسميدهاي نوترکيب(pEYScbm2 و pEYScb?m2) که وزن ملکولي بالاتري نسبت به کنترل داشتند با آنزيم HindIII بريدهشدند. در اثر برش با آنزيم HindIII دو قطعه با وزن ملکولي حدود 5/4 و 3/5 کيلوباز ايجاد ميگردد(شکل 3-24). نتايج فوق با توجه به مارکر وزن ملکولي و مقايسه با پلاسميدهاي pEYScbm1 و pEYScb?m1 صحت کلونينگ را تائيدکرد.

(A)

(B)

شکل3-24. الکتروفورز برش آنزيمي DNA پلاسميدهاي حامل اپرون نوترکيب با آنزيم HindIII بر روي ژل آگارز يک درصد. (A) چاهک مشخص شده با ستاره پلاسميد کنترل (pEYScbm1) حامل ژن cstH و ساير چاهک ها پلاسميدهاي(pEYScbm2) حامل اپرون نوترکيب مي¬باشند. (B) چاهک مشخصشده با ستاره پلاسميد کنترل(pEYScb?m1) حامل ژن cstH و ساير چاهک ها پلاسميدهاي(pEYScb?m2) حامل اپرون نوترکيب مي¬باشند. براي هر دو ژل از مارکر 1Kb DNA استفاده شد.
2-1-3-2-3 تائيد کلونيگ با PCR
کلني هاي نوترکيب انتخاب شده از مرحله اول غربالگري با استفاده از آغازگرهاي ابتدا ( cs3-FF) و انتهاي ( cs3-RR) ژن و يکي از سه آغازگر داخلي (-R, -F1 ويا -F2) مربوط به موتيف و يا بتاموتيف جهت جستجوي حضور DNA اتصالي به کادميوم مورد بررسي قرار گرفتند و نمونه هاي مثبت جهت ادامه بررسي انتخاب شدند(شکل3-25).

(A)

(B)

(C)

شکل 3-25. الکتروفورز محصول واکنش PCR کلونهاي نوترکيب حامل کل اپرون بر روي ژلآگارز يک درصد. ( A) با استفاده از آغازگرهاي ابتدا ( cs3-FF) و انتهاي ( cs3-RR) ژن cstH (B وC) آغازگر ابتدا يا انتهاي ژن و يکي از سه آغازگر داخلي (-R, -F1 ويا -F2). محصول PCR پرايمرهاي cs3FF و cs3 – F1با ش
ماره 1 ، cs3RR و cs3 – Rبا شماره 2 و محصول cs3RR & cs3 – F2 با شماره 3 نامگذاري شدهاست (نام دقيق,pEYSm1 pEYScbm1 و نام دقيق pEYSbm1 pEYScb?m1, ميباشد).

4-2-3 بررسي بيان پيليهاي هيبريد CS3::Cb?m و CS3::Cbm توسط روشهاي داتبلاتينگ باکتري و وسترن پروتئين
يکي از روشهاي مرسوم براي نشاندادن بيان يک پروتئين رديابي آن پروتيئن با آنتيبادي عليه آن ميباشد. در اين تحقيق بعلت اينکه پپتيد متصلشونده به کادميوم براساس توالي آن طي واکنش PCR وارد پيلي شده و آنتيبادي عليه پپتيدهاي وارد شده عملا در دسترس نبود لذا براي اثبات بيان پيلي از آنتيبادي بر ضد CS3 استفاده شد. بدين منظور آنتيبادي هاي ناخالص موجود عليه CS3 با پروتيئن هاي سطحي باکتريِDH5? E. coli جذب شدند و از آن جهت نشاندادن بيان پيليهاي هيبريد استفادهشد.
تاثير احتمالي ورود پپتيد خارجي (پپتيدهاي اتصالي به فلز سنگين) بر بيان پيلي هيبريد روي سطح باکتري توسط روشهاي داتبلات باکتري، وسترنبلات با استفاده از آنتيبادي بر عليه پيلي CS3 مورد مطالعه و بررسي قرارگرفت.
1-4-2-3 دات بلاتينگ باکتري
براي بررسي بيان و تشکيل پلي هيبريد Cs3 روي سطح باکتري با کمک تکينک داتبلات ، کلونهاي pEYScbm2 و pEYScb?m2 به همراه باکتريهاي کنترل (باکتري دارنده پلاسميد pPM4567 حامل اپرون کامل پيلي و باکتري ميزبان بدون پلاسميد) در محيط CFA بترتيب حاوي آنتيبيوتيکهاي آمپيسيلين و کلرامفنيکل و محيط بدون آنتيبيوتيک رشد دادهشدند و پس از گذشت 20 ساعت از کشت مربوطه، سوسپانسيوني از هر يک از باکتريها در PBS با غلظت A600 nm = 0.8 – 1.6تهيه گرديد سپس مقدار lµ 5 از سوسپانسيون روي کاغذ نيتروسلولز نقطه گذاريگرديد. پس از انکوبه کردن با آنتيبادي اوليه (Anti-Cs3)، بيان پيلي روي سطح باکتري با آنتي بادي ثانويه goat-anti rabbit IgG بررسيشد که واکنش هاي مثبت به احتمال زياد نشاندهنده بيان پيلي Cs3 مي¬باشند (شکل3-26). سپس کلونهاي مثبت براي آناليز و بررسي بيشتر با تکنيک وسترنبلات انتخاب شدند.

شکل (3-26). دات بلاتينگ باکتري E. coli بيان کننده پيلي هيبريد با استفاده از آنتيبادي CS3. کنترل مثبت (C+) باکتري E. coli داراي پلاسميدpPM4567 حامل اپرون طبيعي CS3. کنترل منفي (C -) باکتري E. coli بدون پلاسميد. ستون دوم رديف اول باکتري E. coli حامل پلاسميد نوترکيب pEYS38cb?m2. ستون ششم رديف سوم باکتري E. coli حامل پلاسميد نوترکيب pEYS79cbm2. بقيه نمونهها نيز باکتريهاي بيان کننده پلاسميدهاي حامل پيلي نوترکيب مي¬باشند که در متن به آنها اشاره شدهاست.
2-4-2-3 وسترن بلاتينگ
جهت انجام وسترنبلات پروتئينهاي پيلي باکتريهاي حامل پلاسميدهاي نوترکيب pEYScbm2 و pEYSmcb?2توسط ترسيب با %12,TCA102 استخراج شدند. پروتيئن پيلي استخراج شده سپس همراه با نمونههاي کنترل مثبت و منفي روي ژل 13% SDS-PAGE با ولتاژ 140 الکتروفورز شدند. سپس نمونه هاي پروتئين الکتروفورز شده بصورت شبانه با ولتاژ 40 در اتاق سرد روي غشاي PVDF انتقال يافت با توجه به اينکه پروتيئن پيليKD 14.5 و يا 15.5 وزن دارد همانطورکه در شکل3-26 ملاحظه مي شود نمونههاي حامل پلاسميد نوترکيب اندازه سنگينتري نسبت به باکتري حامل اپرون CS3 (کنترل مثبت) دارند. همچنين شکل شماره 7 نشان ميدهد که پروتئينهاي استخراجي از کلونهاي حامل پيليهاي هيبريد واکنش قوي با آنتيبادي عليه CS3 دارند که بيانگر بيان و ارائه پيلي در سطح باکتريهاي نوترکيب و باکتري بيان کننده پيلي طبيعي ميباشد. همانطور که در شکل 3-27 ملاحظه ميگردد آنتيبادي عليه پيلي دو باند در مجاورت هم تشخيص ميدهد دليل اين امر اين است که همانطور که در نتايج بخش بيوانفورماتيکي ذکرشد پيلي CS3 داراي سيگنال پپتيدي مي¬باشد که دو جايگاه برشي دارد (در محل اسيدهايآمينه شماره 7 و 22 ) که اين امر باعث ايجاد دو پروتئين به وزن ملکولي 5/14 و 5/15 کيلودالتوني ميشود. باند کوچکتر داراي پهناي بيشتري مي¬باشد که ميتواند احتمالا به اين دليل است که پروتئين هاي پيلي بيشتر بعد از اسيد¬آمينه شماره 22 بريده ميشوند.

(A)

(B)

شکل 3-27.) Aو (Bوسترن بلاتينگ باکتري E. coli بيانکننده پيلينوترکيب با استفاده از آنتيCS3. pPM4567 پلاسميد حامل پيلي طبيعي و به عنوان کنترل مثبت ميباشد و DH5? باکتري ميزان و به عنوان کنترل منفي مي¬باشد بقيه نمونهها باکتريهاي حامل پلاسميدهاي نوترکيب هستند که مشخصات آنها روي شکل موجوداست.
5-2-3 بررسي نمايش سطحي پيليهاي هيبريد CS3::cb?m و CS3::cbm توسط رنگآميزي ايمونوفلورسانس
جهت بررسي و ارزيابي بيشتر بيان و ارائه پروتئينهاي نوترکيب روي سطح سلول باکتري، از ميکروسکوپ ايمونوفلورسانس استفاده شد.سلول باکتريايي بيان کننده اين پروتئين ها پس از انکوباسيون با آنتيبادي پلي کلونال عليه CS3 سپس با FITC کانجوگه شده با آنتيبادي عليه آنتيبادي خرگوشي (Swine-anti Rabit IgG conjugated fluoreceine isothiocyanate) انکوبه گرديد. همچنانکه در شکل (3-28) نيز نشاندادهشدهاست سلولهاي E. coli بيان کننده پيلي در سطح خود رنگ فلورسانت ساطع ميکنند ولي در کنترل منفي، نور فلورسانسي ساطع نميشود. اين نتايج بيانگر ارائه پيلي نوترکيب و پيلي طبيعي در سطح باکتري و تأييد نتايج حاصل از دات و وسترنبلات است.

شکل 3-28. تصاوير ميکروسکوپ فلوئورسانس باکتريE. coli بيان کننده پيلي نوترکيب با استفاده از آنتيبادي CS3. باکتري ميزبان DH5? به عنوان کنترل منفي، باکتري pPM4567 بيان کننده پيلي طبيعي به عنوان کنترل مثبت، ساير نمونهها حامل پلاسميدهاي نوترکيب مي¬باشند و مشخصات آنها بر روي تصاويري درج شدهاست.

6-2-3 بررسي خاصيت اتصال
به فلز باکتريهاي بيان کننده پيلي CS3 نوترکيب
الف) ظرفيت جذب فلز کادميوم: باکتريهاي مهندسي شده ژنتيکي که بطور پيوسته موتيفهاي اتصالي به کادميوم را عرضه مينمايند، جهت جذب و