تحقیق رایگان درباره سنگين، پروتئين، پروتئينهاي

دسامبر 29, 2018 0 By mitra7--javid
پایان نامه  

درآورده و سپس در جدار خود ذخيره ميکنند، به طوري که جدار خشک اين باکتريها تا 25 درصد حاوي سولفور نقره است.

3-2-1-2-2-9-1 رسوب فلزات مسموم کننده به صورت غيرمستقيم
بعضي از باکتريها آهن را از محيط خارج جذب و در داخل سلول تبديل به آهن سه ظرفيتي يا هيدروکسيد آهن سه ظرفيتي ميکنند که در جريان رسوب، بسياري از يونهاي فلزي ديگر را جذب و همراه خود راسب ميکند و بدين ترتيب يونهاي فلزي مسموم کننده همراه با هيدروکسيدآهن سه ظرفيتي رسوب کرده و از محيط زندگي باکتري خارج ميشوند.

10-1 سازکارهاي ورود فلزات سنگين به ريزسازوارهها
اکثر فلزات سنگين پس از ورود به سلول عملکرد فيزيولوژيکي و يا سميت، خود را بروز ميدهند. بنظر ميرسد کاتيونهاي فلزي دوظرفيتي از لحاظ ساختاري مشابه هم هستند. زيرا کايتونهاي دو ظرفيتي Mn2+، Fe2+، Co2+، Ni2+، Cu2+ و Zn2+ داراي قطر بين138 تا 160 پيکومتر46 بوده(Weast, 1984) و داراي بار مثبت ميباشند. اين شباهت ساختاري تمييز بين آنها را دشوار کرده و ريزسازوارهها نياز به صرف انرژي و زمان براي تشخيص تفاوت بين آنها دارند. غالب سلولها با بکارگيري دو نوع سيستم جذب تا حد زيادي بر مشکل شباهت ساختاري يونهاي فلزي فائق آمدهاند. يکي از اين سيستمها سريع ولي توانايي تمييز محدودي دارد بعبارت ديگر غير اختصاصي عمل ميکند. اين سيستم براي طيف وسيعي از سوبستراها استفادهشده و ژنهاي آن بيان دائمي دارند. سيستمهاي سريع معمولا براساس گراديانت شيموتوکسيک در غشاي سيتوپلاسمي باکتريها عمل ميکنند. دومين سيستم جذب، اختصاصي ولي داراي سرعت پاييني ميباشد و در اغلب موارد با مصرف انرژي حاصل از هيدروليز ATP و برخي شرايط نيز با منبع انرژي گراديان شيموستاتيک فعاليت ميکنند. چنين سيستمهايي القائي بوده و فقط در مواقع نياز سلولي مانند گرسنگي يا وضعيت خاص متابوليکي فعال ميشوند (Nies and Silver 1995). سه خانواده مهم ناقلهاي انتقال فعال و اختصاصي فلزات سنگين در باکتريها عبارتند از: (1) پمپهاي ابرخانواده RND47 که علاوه بر ناقل بودن، در تقسيم سلولي و گرههاي غشايي نيز نقش دارند (2) کاريرها يا تسهيل کنندههاي انتشار کاتيونها48 و(3) پمپهاي يوني گروه P-type ATPases. جدول 1-3 چند نمونه مهم از پروتئينهاي ناقل فلزات سنگين را نشان ميدهد (Nies, 1999) (Nies, 2003).

جدول 1-3. خانوادههاي مهم پروتئينهاي دخيل در نقل وانتقالات فلزات سنگين در باکتريها

CPM49 غشاي سيتوپلاسمي، ABC کاست اتصالي به ATP ، CHR 50ناقل کرومات و MIT51 ناقل غيرآلي فلز

تحمل و مقاومت به کادميوم درتعدادي از باکتريها از قبيل باکتريهايStaphylococcus aureus و Listeria monocytogenesتوسط ناقلهاي پروتئيني از دسته P1-type ATPases به نام CadA52 انجام ميگيرد. اين پروتئين از 8 مارپيچ غشايي تشکيل شده که دمين اتصال به فلز، در انتهاي آميني پروتئين قرارگرفته و متشکل از 71 اسيد آمينه با تاخوردگي شبه فرودکسيني?1?1?2?3?2?4 ميباشد (شکل 1-3). ناحيه اتصالي به فلز سنگين که به نام HMA_1 53خوانده ميشود حامل توالي توافقي CXXC در لوپ 1 در ناحيه بين 1 ? و 1 ? ميباشد. دو اسيد آمينه سيستئين (سيستئين 14 و 17) نقش اساسي را در اتصال به فلز برعهده دارند ( شکل1-3). لازم به ذکر است که در ساير سيستمهاي انتقال فلز نيز حضور سيستئين مشاهده شدهاست که درشکل3-3 چند نمونه از اين پروتئينها به همراه تطابق توالي آنها ارائه شدهاست (Banci et al., 2006) .

(الف) (ب)
شکل 1-3. (الف).آرايش عناصر ساختار دوم دومين HMA در پروتئين CadA که از پايگاه داده PDBsum بدست آمدهاست و (ب) اندرکنش فلز سنگين با اسيدهايآمينه سيسئين موجود در پروتئين ناقل فلز سنگين .(Banci et al., 2006)

در اين مطالعه، موتيف اتصالي به کادميوم از بخش انتهايآميني پروتئين CadA (HMA_1) استخراج گرديد و جهت بيان در منطقه مجاز پيلي CS3 وارد و در سطح سلول عرضه گرديد در بخشهاي بعدي توضيحات بيشتري در اين خصوص ارائه شدهاست.

11-1 پروتئينها و پپتيدهاي عمومي متصل شونده به فلزات سنگين
بسياري از مواد زيستي ميل ترکيبي به فلزات را نشان ميدهند. سازکارهاي متعددي که توسط آنها فلزات با ديواره و پوشش سلولهاي ميکروبي بر هم کنش دارند، بخوبي شناخته شدهاست. معهذا برخي از بيوملکولها به طور اختصاصي به فلزات متصل ميشوند و آنها را در حضور خود احياء ميکنند. پروتيئنها و پپتيدهاي اختصاصي متصل شونده به فلز در تمام گروههاي ميکروبي مورد آزمايش، گزارش شده اما بيشتر تحقيقات بر روي مخمرها صورت گرفتهاست .(Gadd and White, 1993, Saleem et al., 2008)
متالوتيونينها( MT)54 دستهاي از ملکولهاي با وزن ملکولي کم و غني از سيستئين هستند که در همه موجودات از گياهان گرفته تا يوکاريوتها و برخي از ريزسازوارههاي پروکاريوتي بيان ميشوند و به دليل وجود محتواي بالاي سيستئين در سميت زدايي 55 فلزات سنگين و تنظيم هموستازي زيستي يونهاي مانند روي و مس نقش ويژه اي ايفا ميکنند ميزان سنتز اين پروتيئن در مواجه سلول با فلزات دو ظرفيتي مانند کادميوم، مس و نيکل و غيره افزايش مييابد. اين پروتئين داراي سه کلاس مختلف ميباشد که در باکتريها کلاس دو آن وجود دارد. تواليهاي اين پلي پپتيد، غني از اسيد آمينه سيستئين است که با آرايش Cys-X-Cys، Cys-Cys و Cys-X-X-Cys در پروتئين قرار ميگيرند. الگوي خاصي از پيوندهاي ديسولفيد بين اسيدهايآمينه سيستئين اتصال آن را به فلزات ضروري در سوخت و ساز سلولي مانند روي و مس تضمين ميکند. متالوتيونينها همچنين توانايي اتصال به عناصر سمي مانند کادميوم، سرب، جيوه، کروم، نيکل و تر
کيبات آرسنيکي را دارا ميباشند.(Chen and Georgiou, 2002)
علاوه بر متالوتيونينها که مسئول اتصال به يونهاي فلزي و خارج نمودن آنها از دسترس سلول و کاهش حالت فعال اين يونها درون سلول هستند، تري پپتيد گلوتاتيون56 و پروتئينهاي به نام فيتوچلاتينها57 از طريق گروه سولفيدريل با يونهاي فلزي واکنش ميدهند و بدين ترتيب مانع فعاليت يونهاي آزاد در سيتوپلاسم سلول ميشوند (شکل1-4).
فيتوچلاتينها (PCs) پپتيدهاي مشتق از گلوتاتيون بوده که در گياهان در زمان قرار گرفتن در معرض تنش فلزات سنگين ساخته ميشوند. فيتوچلاتينها در مقايسه با ساير پپتيدها مقادير و طيف بيشتري از يونهاي فلزي را جذب ميکنند (شکل1-4).
دسته ديگر پپتيد‌هاي متصل شونده به فلزات فيتوچلاتين سنتز شده58 (ECs) (شکل 1-4) با فرمول عمومي (n=8-20) (Glu-Cys)n Gly ميباشند كه تقريبا با ظرفيت دو برابر يا بيشترنسبت به MTs‌ها به فلزات متصل ميشوند (.(Bae et al 2000 اما همگي اين پروتئين‌ها در جذب عناصر سنگين محدوديتي دارند و سلول توانايي جذب و انباشته نمودن مقدار زيادي يون‌هاي فلزي توسط اين پروتئين‌ها را ندارد. از جمله استراتژي‌‌هاي جديد جذب فلزات سنگين استفاده از نمايش پروتئين يا پپتيد جاذب فلزات سنگين بر روي سطح باكتري است به نحوي كه بتواند به فلزات متصل شود. علاوه بر پپتيد‌هاي غني از سيستئين پپتيد‌هاي غني از هيستيدين مانند توالي Gly-His-His-pro-His-Gly (به نام HP)، هگزا هيستيدين نيز به صورت‌‌هاي His6 يا His3-Glu-His3، پلي هيستيدين به صورت پپتيد (His6)n و پپتيد‌‌هايي با تركيب غني از هيستيدين و سيستئين، براي اتصال وجذب فلزاتي نظير نيكل و كادميم استفاده شدهاست (Saleem et al., 2008, Vijayaraghavan and Yun, 2008).
از آنجا كه روش‌‌هاي رايج فيزيكي وشيميايي ذكر شده در غلظت‌‌هاي پايين فلزات سنگين كارآيي ندارند و بسيار گران و پر هزينه هستند و نيز با توجه به اين‌كه صنعت به دنبال روش ارزان و مناسب براي جذب فلزات است، بنابراين در دهههاي اخير به روش‌هاي زيستي به ويژه روش‌هاي ميكروبي متوسل شدهاند. از طرف ديگر بکاربردن ريزسازوارهها براي جذب فلزات سنگين بدون دستکاريهاي ژنتيکي داراي محدوديتهاي ميباشد که ميتوان به مواردي مانند (1) پايين بودن امکان جذب گزينشي (2) محدويت بالاي ظرفيت جذب در ريزسازوارههاي طبيعي (3) پايين بودن ميزان استحصال فلز جذب شده از ريزسازواره (4) عدم امکان بهره برداري دوباره از ريزسازوارههاي استفاده شده، اشاره نمود. از اينرو در سالهاي اخير محققين در صدد افزايش بيان پروتئينهاي جاذب در ريزسازوارههاي نوترکيب بودند ولي اين سيستمهاي بيان نيز با مشکلاتي از قبيل محدود بودن ظرفيت جذب و عدم امکان بهره برداري دوباره از ريزسازوارههاي استفاده شده مواجه ميباشند. لذا امروزه بخصوص از دهه 90 به بعد نمايش پپتيد‌‌هاي جذب‌كننده فلزات سنگين روي سطح باكتري از جمله روش‌هاي نوين بيوتكنولوژي در حذف فلزات سنگين در غلظت پايين و افزايش امکان جذب گزينشي مي‌باشد نمايش پپتيد روي سطح باكتري توسط اتصال آن‌ها به ضمائم سطحي يا پروتئين‌‌هاي سطحي باكتري‌ها انجام مي‌شود (Kotrba et al., 1999a, Kuroda and Ueda, 2010, Bae et al., 2002, Bae et al., 2000)

شکل 1-4. ساختار شيميايي فيتوچلاتين طبيعي(بالا سمت راست) و فيتوچلاتين سنتزشده(پايين سمت راست). به اختلاف پيوند بين گلوتاميک و سيستئين توجه شود. واکنش بين اسيدآمينه سيستئين موجود در فيتوچلاتين و فلز کادميوم(سمت چپ) (Bae et al., 2000)
12-1 نمايش سطحي باکتريايي
نمايش سطحي پروتئينهاي هترولوگ در روي سطح ريزسازوارهها، که بوسيله تکنولوژي DNA نوترکيب امکان پذير شدهاست علاوه بر کاربردهاي وسيعي که در توليد و تهيه واکسنهاي باکتريايي، غربالگري کتابخانههاي پپتيدي، توليد آنتي باديها، توليد بيوکاتاليستهاي نوترکيب و توسعه بيوسنسورها دارد، به عنوان يک روش استراتژيک جهت حذف فلزات سنگين مورد توجه محقيقين قرار گرفتهاست (Bae et al., 2002, Dong et al., 2006, Narita et al., 2006, Gao et al., 2001).
از باکتريهاي گرم مثبت و گرم منفي در سيستم نمايش سطحي باکتريايي استفاده شدهاست. با توجه به اختلاف ساختار غشاء و ديواره سلولي بين اين دو دسته باکتري (شکل 1-5)، در ادامه به بررسي کاربرد دو گروه باکتري در مطالعات مهندسي ژنتيک ميپردازيم.

شکل 1-5. ترکيبات سطحي باکتريهاي گرممنفي و گرممثبت. همه ساختارهاي نشان داده شده در تمامي باکتريها وجود ندارد. براي مثال پروتئين M فقط در تعدادي از باکتريهاي استرپتوکوکوس يافت ميشود و همچنين تاژک در تعدادي از آنها وجود دارد(Wang and Chen, 2009).

1-12-1 نمايشسطحي در باکتريهاي گرممنفي
باکتريهاي گرم منفي داراي يک غشاء پلاسمايي دو لايه متشکل از فسفوليپيد و پروتئين در نيمه داخلي و همچنين يک غشا خارجي نامتقارن شامل ليپوپلي ساکاريد (LPS) و پروتئينهاي مختلف از جمله پورين59ها ميباشند. فضاي بين دو غشاء داخلي و خارجي پري پلاسم ناميده ميشود که شامل پپتيدوگليکان ميباشد(شکل1-5) (Wang and Chen, 2009).
از باکتريهاي گرم منفي و گرم مثبت در سيستم نمايش سطحي باکتريايي استفاده ميشود. در ميان باکتريهاي گرم منفي، باکتري Escherichia coli بطور گستردهاي براي مهندسي سطح سلول مورد مطالعه قرار گرفتهاست. باکتري E. coli يک باکتري گرم منفي پرطرفدار است زيرا اين باکتري علاوه بر داشتن ابزارهاي ژنتيکي متنوع، سويههاي جهش يافته آن کارايي بالايي جهت ترانسفورماسيون دارند که اين امکان را فراهم ميکند که کتابخانههاي بزرگ پپتيدي و پروتئيني را بسهولت بتوان با کمک اين باکتري غربال کرد(Lee et al., 2003).

استراتژيهاي متفاوتي جهت ارائه پروتئينهاي هترولوگ روي سطح باکتري E. coli ارائه شده است که شامل:
(1)ورود تواليهاي هدف در لوپهاي سطحي پروتئينهاي غشاي خارجي مانند پروتئين OmpA و OmpC. مطالعات نشان داده است که لوپهاي موجود در ساختار اين پروتئين ناحيه مناسبي براي ورود پروتئينهاي خارجي ميباشند. شکل(1-6) پروتئين OmpC را با لوپهاي مجاز براي ورود اپيتوپ خارجي نشان ميدهد.
(2)اتصال تواليهاي هدف به بخش N ترمينال ليپوپروتئينها. اين دسته از پروتيئنها مانند TraT از طريق ليپيد به غشا خارجي متصل ميشوند. اپيتوپهاي ويروسي از پوليوويروس در موقعيتهاي