تحقیق رایگان درباره ساختار داده

دسامبر 29, 2018 0 By mitra7--javid
پایان نامه  

مدل ساز خودکاري است که با حداقل ورودي و داده کاربر يعني در سادهترين حالت فقط با توالي آمينواسيدي پروتئين هدف کار ميکند. از آنجائيکه پروژه هاي مدلسازي مقايسهاي داراي پيچيده گيهاي متفاوتي هستند، ازاينرو وروديهاي بيشتري براي انجام برخي از پروژه هاي مدلسازي ، براي مثال جهت انتخاب يک الگوي متفاوت و يا تنظيم همرديفي الگو-هدف لازم است. بنابراين، سرور SWISS-MODEL به کاربر اين امکان را ميدهد از بين سه روش (1): انطباق خودکار70، طريقه دستي 71 و روش همرديفي72 ، يکي را براساس نيازخود انتخاب نمايد. در رويکرد اوليه کاربر توالي آمينواسيدي را به عنوان داده وارد سرور نموده سپس سرور بطورخودکارالگوي مناسب را انتخاب مينمايد و کاربرد بطوراختياري ميتواند بيش از 5 ساختار را به عنوان الگو از کتابخانه ExPDB و يا از PDB گزينش کند.
روش مدلسازي خودکار در صورتي آغاز ميشود که حداقل يک الگو با يکسانيت توالي بيش از 25% از توالي هدف ارسال شده موجود باشد. بهرحال بهتر است کاربر اطلاع داشته باشد که هرچه يکسانيت توالي کاهش يابد اعتبار مدل ساخته شده نيز کاهش پيدا ميکند. در اغلب موارد اگر يکسانيت توالي بين الگو- هدف کمتر از 50% باشد نياز به تنظيم دستي همرديفي است.( 2): در طريقه همرديفي، مدلسازي با ارسال يک توالي همرديف آغاز مي شود و کاربر تعيين مي کند که کدام توالي به عنوان توالي هدف و کداميک به ساختار شناخته شده در کتابخانه ExPDB مربوط مي شوند سپس سرور مدلي را برپايه همرديف معرفي شده، براي کاربر ارائه مي دهد.( 3): در حالت طريقه پروژه، کاربر يک فايل انطباق توالي را در DeepViewer ساخته و آنرا براي ساخت مدل به سرور ارسال مي کند. از مزاياي اين روش اينست که به کاربر اجازه ميدهد طيف وسيعي از پارامترها را مانند انتخاب الگو ، پرکردن شکافها در همرديفي را کنترل کند(Konstantin, 2006).

2-2-2-2-2 مدلسازي با برنامه Modeller
برنامه Modeller با توجه به قوانين ممانعت فضايي مطلوب73 با استفاده از يک الگوي ساختاري، ساختارهاي پروتئيني را مدلسازي ميکند. بعلاوه بسياري از اعمال ديگر مانند مدلسازي ابتدا به ساکن در بخش لوپها، بهينه سازي انواع مدلهاي پروتئيني با استفاده از معياري به نامObjective function، انطباق چندگانه74 تواليها يا ساختارهاي پروتئيني، خوشه سازي يا دستهبندي75، جستجوي بانکهاي اطلاعاتي، مقايسه ساختارهاي پروتئيني و … را نيز انجام ميدهد.

بطور کلي فايلهاي ورودي برنامه Modeller سه نوع هستند:(1)يک نوع فايل حاوي تواليها و انطباق آنها،(2)فايلي که مربوط به اطلاعات اتمي فايلهاي الگو يعني PDB آنها(3)و در آخر يک فايل متني حاوي دستور کار به زبان Python. دستورات در قالب فايلهاي متني که به زبان برنامه نويسي Python نوشته شدهاند به برنامه داده شده و Modeller بر اساس موضوع، تغييرات لازم را انجام داده و مدل مورد نظر را بصورت فايل PDB حاوي مختصات سه بعدي ميسازد. روش کار با اين نرمافزار بصورت راهنماي عملي، در صفحه اصلي اين نرمافزار در آدرس الکترونيکي WWW.saliab.org/modeller موجوداست.

3-2-2-2 مدلسازي براساس روش شناسايي تاخوردگي76
روش شناسايي تاخورگي پروتيئني بر پايه اين اصل استوار است که تعداد تاخوردگي و تاخوردگيهاي پروتئين نسبت به تعداد پروتئين هاي موجود در طبيعت (که از طريق پروژه هاي ژنوم استخراج شدهاند) بسيار کمتر و محدودتر است. ساختارهاي ذخيره شده در پايگاهداده پروتئين را براساس تاخوردگي آنها به خانواده هايي تقسيم مي کنند. مطالعات اخير نشان دادهاست که تعداد کافي ساختار براي پوشش دادن پروتئين هاي کوچک در پايگاه داده پروتئين موجود است .(Kihara and Skolnick, 2003) در اين روش توالي آمينواسيدهاي پروتئيني که ساختار آنرا نمي دانيم در مقابل يک بانک اطلاعاتي از ساختارهاي تعيين شده، جستجو مي گردد و در هر مورد يک پارامتر امتيازدهي براي تعيين ميزان هم خواني توالي با ساختار استفاده مي شود و مدلهاي سه بعدي محتمل پيشنهاد مي شود.
به اين روش شناسايي تاخوردگي روش 3D-1D نيز گفته ميشود چرا که بررسي همخواني ميان ساختار سه بعدي و توالي آمينو اسيد خطي انحام ميگيرد. اين روش همچنين يک روش معکوس به نام inverse search را هم به استفاده از ارزيابي همخواني يک ساختار دادهشده با يک بانک اطلاعاتي توالي و براي پيشگويي اينکه کدام توالي ها توانايي شکل گيري به فرم تاخوردگي داده شده را دارند، انجام ميدهد.از برنامه و سرورهاي پرکاربرد در روش شناسايي تاخوردگي سرور Phyre و اخيرا Phyre2 ميباشد.
جهت شناسايي تاخوردگي پروتئين ابتدا ساختار دوم پروتئين هاي مورد بررسي پيشگويي گرديد سپس ارسال توالي پروتئين به سرور شناساگر تاخوردگي (Fold ) پروتئين(PHYRE) مدل سهبعدي براي توالي ارائه گرديد.اگر الگوهاي پيشنهادي با توالي مورد جستجو در يک خانواده پروتئيني از لحاظ عملکردي و ساختاري قرار گيرند در اينصورت آناليز و بررسي هاي بعدي مانند همرديفي پييشگويي ساختارهاي دوم با ساختارهاي دوم الگو انجام ميگيرد. مرحله بعدي بررسي کيفيت مدل هاي گزينش شده مي باشد که با روشهاي ذکر شده در بخش مدلسازي مقايسهاي قابل انجام است.
4-2-2-2 شبيه‌سازي ديناميک مولکولي با استفاده از نرم‌افزار GROMACS
در نتيجه شبيهسازي ديناميکملکولي يک پروتئين يا اسيدنوکلئيک، رفتار ماکروملکول يا سيستم در طي يک زمان مشخص و مورد نظراست که با استفاده از معادلات حرکت نيوتن و توابع انرژي پتانسيل به دست مي آيد. خروجي شبيه سازي يک سري از ساختارهاي ايجاد شده در طي زمان شبيهسازي است که روند تغييرات ساخت
ار را در طي زمان مورد نظر ارائه ميدهد که چگونگي اين تغييرات ديناميک سيستم يا ملکول را منعکس مي کند. در اين راستا نرم‌افزارهاي شبيه‌سازي بسياري با کاربردهاي گوناگون ارائه شده است. از آنجمله مي‌توان به نرم‌افزارهاي امبر(AMBER)، چارم(CHARMM)، نمد(NAMD)، گرومکس (GROMACS) و … اشاره کرد که در بين آنها استفاده از نرم‌افزار گرومکس به علت سادگي، در دسترس بودن و پيشرفت روزافزون آن از گستردگي بيشتري برخوردار است.
5-2-2-2 تغييرات RMSD
کميت RMSD معياري جهت مقايسه شباهت دو ساختار ملکولي است. بدين ترتيب که مقدار RMSD برابر صفر بيانگر اين است که دو ملکول در فضا کاملا برهم منطبق هستند. براي اندازهگيري کميت RMSD از نرم افزار Swiss-pdb viewer و همچنين برنامه تحت شبکه CE استفاده گرديد که مراحل کار بشرح زير ميباشد

1-5-2-2-2اندازه گيري RMSD با نرم افزار Swiss-pdb viewer
ابزار اندازه گيري RMSD در نرم افزار Swiss-pdb viewer تعبيه شده که مقايسه را برحسب انتخاب کاربر برروي کربنهاي آلفا، زنجيره هاي جانبي، کربنهاي اسکلتملکول و يا کل اتمهاي دو ملکول انجام مي دهد. در فرايند مقايسه يکي از ساختارها در جهت عرضي يا عمودي نسبت به ساختار ديگر جابجا شده بطوريکه دو ملکول در مختصات مشابهي قرار ميگيرند سپس ساختارها حول محورهاي سه بعدي جابجا و فواصل بين اتمهاي آنها اندازه گيري ميشود و با رسيدن به کوتاهترين فاصله چرخش متوقف شده و فواصل بين موقعيت هاي هم ارز اندازه بر حسب انحراف از مجذور ميانگين مربعات يا همان RMSD اندازه گيري و برحسب آنگسترم ارائه ميشود. RMSD هاي کمتر از A° 5 با بيشترين طول انطباقي بيانگر انطباق بهينه بين دو ملکول ميباشد (Shindyalov and Bourne, 1998, Kaplan and Littlejohn, 2001)).

2-5-2-2-2اندازهگيري RMSD با برنامه تحت شبکه CE
CE برنامه تحت شبکه ميباشد و مقايسه را با ايجاد ماتريسهاي فاصلهاي که بين کربنهاي آلفاي دو ملکول انجام ميدهد. تشابهات حاصل به نام زوج قطعات منطبق (AFPs77) ناميده ميشود. سپس با يک روش مکاشفهاي اين زوج قطعات منطبق در يک سري يا رده مسير مناسب و بهينه به يکديگر محلق شده البته در برخي مناطق ممکن است افتادگيهايي نيز وجود داشتهباشد. مسيري که بهترين RMSD را بدست ميآورد براي کسب انطباق مطلوب به برنامهنويسي پويا78 ارائه ميگردد و نتيجه آن بر حسب امتياز Z به کاربر ارائه مي شود امتياز Z بالاي 3.5 نشاندهنده ساختار مشابه دو مکلول ميباشد.
3-2-2 پيشگويي سطوح در دسترس و سطوح مشترک بين دو پروتئين
سطوح در دسترس پروتئين مناطقي را شامل ميشوند که ميتوانند در دسترس محيط باشند بعبارت ديگر وارد کردن قطعات بيگانه در اين مناطق احتمال ارائه آنها را به محيط افزايش ميدهد از طرف ديگر سطوح در ميانکش پروتئين ها نيز بايد شناسايي شوند تا از دستورزي کنار گذاشته شوند. بعبارت بهتر بنابراين در اينگونه مطالعات داشتن هرگونه اطلاعاتي درباره سطح در دسترس و در ميانکش ميتواند مفيد باشد. جهت شناسايي اين مناطق از برنامههاي Protscale، Vadar،Getarea، Meta-PPISP و همچنين از روش داکينگ ملکولي Cluspro و GRAMM-X استفاده شد.

3-2 مواد
1-3-2 ترکيبات استفادهشده
اتيديوم برومايد، نيترات سرب، نيترات کادميم، سولفات نيکل ( از شرکت سيگما)، اتيلن دي آمين تترا استيک اسيد (EDTA)، اسيد استيک غليظ، اسيد کلريدريک، آگار، آگارز، ايزوپروپانل، 2- بوتانل، کلريد منيزيم، سولفات منيزيم، سولفات مس، سولفات روي، کلريد کليسم، آمونيم پرسولفات (APS)، استات سديم، فنل، کلروفرم، گليسرول، اتانل مطلق، برموفنل بلو، سديم دودسيل سولفات (SDS)، بتامرکاپتواتانل، کوماسي بلو، تريس اسيدي، آکريل آميد، سديمآزيد، پپتون، آلبومين سرم گاوي (BSA)، (,HRP Horse Radish Peroxidas) (از شرکت مرك آلمان با درجه خلوص بيولوژي مولكولي)، دي اکسي نوکلئوتيدتريفسفات شامل دياکسيتيميدينتريفسفات، دياکسيآدنوزينتريفسفات، دياکسيسيتوزينتريفسفات، دياکسيگوانوزينتري فسفات(از شرکت Roche) کازامينواسيد (از شرکت Difco)
2-3-2 آنتي بيوتيک ها
آمپيسيلين (amp) با غلظت 100mg/ml، کلرامفنيکل با غلظت 30 mg/ml و تتراسايکلين12.5 mg/ml در فريزر 20- درجه سانتيگراد نگهداري شد.(آنتيبيوتيک هااز شرکت Roche تهيه گرديدند).
3-3-2 آنتي باديهاي اوليه
از آنتيبادي پلي کلونال ضدپيليCS3 (Rabbit anti CS3) تهيه شده در پژوهشگاه ملي مهندسيژنتيک و زيستفناوري پس از جذب با پروتيئن سطحي باکتري ميزبان استفاده گرديد.
4-3-2 آنتي باديهاي ثانويه
Goat – anti-rabbit -Immunoglubin horseradish peroxidase conjugate (Roche )
Swine – anti-rabbit IgG fluorescein isothiocyanate(FITC ) conjugate (Dako)
Rabbit – anti mouse IgG fluorescein isothiocyanate(FITC ) conjugate (Dako)
5-3-2 باکتريها
در اين تحقيق از باکتري E. coli DH5?، با مشخصات ژنتيکي زير به منظور تهيه سلولهاي مستعد و همسانه سازي ناقلين پلاسميدي استفاده شد.
F-, gyrA96 (Nalr) ?(lacZYA-argF) U169 [?80dlacZ?M15] deoR, relA1 , recA1,
endA1, hsdR17(rK-, mK+), phoA, supE44, ?-, thi-1.

6-3-2 پلاسميدها
پلاسميدهايي که در اين تحقيق مورد استفاده قرارگرفته و يا ساخته شدهاند، به همراه ويژگي و منابع تأمين کننده آنها در جدول 2-8 ارائه شدهاست.
جدول 2-8.. مشخصات پلاسميدهاي استفادهشده و يا ساختهشده در اين تحقيق
پلاسميد
مارکر
ويژگي
منبع
pBR322

Amp-Tet
وکتور کلونينگ
پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيک
pPM4556
Amp
وکتور pBR322 حامل ژن cstH (زير واحد اصلي پيلي CS3)
Yakhchali and Manning, 1997
pPM4567
Cm
وکتور pBC حامل کل اپرون cst که براي ساخت و بيان پيلي هيبريد استفاده شد
Yakhchali and Manning, 1997
pEYS38cbm1
Amp
پلاسميد pBR322 داراي موتيف ات
صالي به کادميوم از پروتيئن CadA در جايگاه مجاز موقعيت 38 پروتئين CStH
اين تحقيق
pEYS38cb?m1
Amp
پلاسميد pBR322 داراي موتيف تصالي به کادميوم و زنجيره ? همسايه از پروتيئن CadA در جايگاه مجاز موقعيت 38 پروتئين CStH
اين تحقيق
pEYS38cbm2
Amp
پلاسميد pBR322 حاوي اپرون cst نوترکيب بيان کننده موتيف اتصالي به کادميوم در موقعيت 38 پروتئين CStH
اين تحقيق
pEYS38cb?m2
Amp
پلاسميد pBR322 حاوي اپرون cst نوترکيب بيانکننده بتا-موتيف اتصالي به کادميوم در موقعيت 38