تحقیق رایگان درباره ثبت اختراعات

دسامبر 29, 2018 0 By mitra7--javid
پایان نامه  

. الکتروفورز محصولات SOEing-PCR
100
شکل 3-17. نحوه کلونينگ محصولات SOEing PCR در ناقل pBR322
102
شکل 3-18. الکتروفورز DNA پلاسميد pBR322 و کلونهاي نوترکيب بر روي ژل آگارز يک درصد
103
شکل 3- 19. الکتروفورز محصولاتPCR کلون هاي نوترکيب
شکل 3-20. الکتروفورز محصول برش آنزيمي DNA نوترکيب با آنزيمهاي AocI و. BamH1
104
105
شکل3- 21. شکل شماتيک کلونينگ ژن هيبريد cstH::cbm و cstH::cb?m در اپرون پيلي CS3
107
شکل3 -22. برش آنزيمي پلاسميد pPM4567 و پلاسميدهاي نوترکيب
108
شکل 3-23. الکتروفورز DNA پلاسميدهاي نوترکيب pEYSm2 و pEYSbm2 روي ژل آگارز يک درصد.
109
شکل3-24. الکتروفورز برش آنزيمي DNA پلاسميدهاي حامل اپرون نوترکيب با آنزيم HindIII بر روي ژل آگارز يک درصد
110
شکل 3-25. الکتروفورز محصول واکنش PCR کلونهاي نوترکيب حامل کل اپرون بر روي ژل آگارز يک درصد.
112
شکل 3-26. دات بلاتينگ باکتري E. coli بيان کننده پيلي هيبريد با استفاده از آنتيبادي CS3
113
شکل 3-27. وسترن بلاتينگ باکتري E. coli بيان کننده پيلي نوترکيب با استفاده از آنتيCS3.
115
شکل 3-28. تصاوير ميکروسکوپ فلوئورسانس باکتريE. coli بيان کننده پيلي نوترکيب با استفاده از آنتيبادي CS3
116
شکل 3- 29. منحني ظرفيت جذب کادميوم در باکتري بيان کننده موتيف اتصالي به کادميوم و باکتري E. coli ميزبان
117
شکل 3-30. بررسي اثر عامل زمان بر جذب کادميوم در باکتريهاي مهندسي شده
118
شکل 3-31. مقايسه جذب کادميوم در سلولهاي کنترل و سلولهاي نوترکيب
120
شکل 4- 1. ساختار دمين متصل شونده به فلز واقع در انتهايآميني پروتئين CadA باکتري ليستريا مونوسيتوژن و مدل پيشنهادي براي نحوه پيوند فلز با موتيف
128

1- مقدمه و مروري بر مطالب گذشته
1-1 زيستفناوري
زيستفناوري يکي از محورهاي اساسي توسعه در بسياري از کشورها قلمداد شده و در تنظيم راهکارها و برنامهريزيهاي ملي توجه جدي به آن معطوف شدهاست. اين دسته از کشورها در حوزههاي مختلف مانند کشاورزي، داروسازي، محيط زيست و حوزههاي بسيار جديد مانند تراشههاي زيستي1 و سوختهاي زيستي2، بهره فراواني از زيستفناوري کسب کردهاند (Report,2011, Nikaido., 2003).
حفاظت محيطزيست و در نظرگرفتن آن به عنوان يک جزء از سرمايه ملي کشورها و لزوم حفظ آن با به‌کارگيري زيست‌فناوري يکي از حوزههاي مهم پيشرفت بشري در نيمه دوم قرن بيستم ميباشد. امروزه در برخي از معادن دنيا، استخراج و بازيافت کانيهاي پرارزشي مانند طلا، نقره، مس و اورانيوم به کمک ريزسازوارهها و با روشهاي فروشويي زيستي3 صورت ميگيرد (Sasson, 2005, Grommen and Verstraete, 2002). توليد پلاستيکهاي قابل تجزيه4 (Sasson, 2005)، توليد انرژيهاي تجديد پذير با استفاده از تودههاي زيستي5 (Chakrabarti, 2009)، طراحي و توليد ساختارهاي نانومتري6 جديد مثل ترانزيستورها7 و تراشههاي زيستي، پليمرهاي پروتئيني، افزايش بازيافت و سولفورزدايي نفت خام و پاکسازي آلودگيهاي زيست محيطي، حذف مؤثر آلاينده‌هاي محيطي خطرناک و استفاده از فنون نگهداري ذخاير ژنتيکي از جمله کاربردهاي زيست‌فناوري در زمينه محيط زيست و صنعت است (Kotrba et al., 1999a EuropaBio, 2003 ,).
در چند دهه اخير با ابداع روشهاي نوين در زيستفناوري بخصوص ورود بيوانفورماتيک به عرصه مهندسي پروتيئن تغييرات چشمگيري در راهبردهاي حذف زيستي براي افزايش حذف آلايندهها بوجود آمدهاست. دراين تحقيق سعي شده است تواناييها و امکانات موجود در اين دانش به عنوان ابزاري جهت بهبود و ارتقا روشهاي پيشين حذف فلزات سنگين مورد بررسي و استفاده قرارگيرد.
2-1 بيوانفورماتيک و نقش آن در زيستفناوري
دانش بيوانفورماتيک يکي از جديدترين حوزههاي علمياست که با بهرهگيري از علوم کامپيوتر، رياضيات (بويژه آمار) و اطلاعات زيستشناسي مولكولي- توالي‌ ژنها و پروتئينها را در بانکهاي اطلاعاتي ذخيره نموده و با ابزارهاي کامپيوتري و الگوريتمهاي قدرتمند رياضي آنها را آناليز و تحليل مينمايد. اين علم به سرعت در حال رشد ميباشد و ابزارهاي بيوانفورماتيک، قابليت‌هاي سودمندي در تحقيق و توسعه صنايع مختلف از جمله داروسازي، مهندسي پزشکي، معادن و پاکسازي زيستي پيدا کردهاست.
در تکنولوژي حذفزيستي از پتانسيل و توانايي ميکربها براي تجزيه ترکيبات مضر استفاده ميگردد. ريزسازوارهها طيف قابل توجهي از آلاينده ها را تجزيه کرده و آنها را به شرايط طبيعي برميگردانند. امروزه نه تنها تحقيقات فراواني جهت بکارگيري پتانسيلهاي موجود در حوزههاي ژنوميکس8 و پروتئوميکس9 ميکروبي جهت حذف زيستي آلايندههايي مانند فلزات سنگين در حال انجاماست. بلکه ضروري بنظر ميرسد که علاوه بر توسعه مطالعات در حوزههاي ژنوميکس، پروتئوميکس، مطالعات و فعاليتهاي بيشتري در زمينه توسعه و گسترش پايگاههاي داده، زيستشناسي سيستمها10، زيست شناسيمحاسباتي11، درختهاي فيلوژنتيکي12 و همچنين بهره برداري و بکارگيري هرچه بيشتر و تخصصيتر ابزارها و امکانات اين دانش جهت استخراج و دسترسي آسان به اطلاعات پروتئينها و اسيدهاي نوکلئيک، تعيين و پيشگويي ساختارهاي سهبعدي پروتئينها و مسيرهاي تجزيه زيستي ترکيبات مخرب محيط زيست انجامپذيرد. (Sharma, 2008, Bansal, 2005).
1-2-1 پايگاه داده
پايگاه داده13 يک برنامه کامپيوتري است که با روشهاي بسيار منظمياطلاعات را در کامپيوتر ذخيره ميکند و با سرعت فوق العادهاي، در آن اطلاعات جستجو کرده و نتي
جه جستجو را ارائه ميدهد (xiong,2006)
بدليل افزايش دادههاي زيستي اعم از مقالات، ثبت اختراعات، گزارشات تواليهاي نوکلئوتيدي يا اسيدهاي آمينه و ساختارهاي سهبعدي ماکروملکولها، ايجاد پايگاههاي زيستي ضرورت يافتهاست .يکي از اولين پايگاههايداده، GeneBank (Benson et al., 2011) ميباشد که در سال 1982 با 5 توالي شروع شد. هم اکنون اين پايگاه بيش از 80 ميليون رکورد14 را در خود جاي دادهاست، اين پايگاهداده توسط مرکز ملي اطلاعات زيست فناوري15 سرپرستي ميشود. دستجات مختلفي از پايگاههاي اطلاعاتي زيستي وجود دارد که دو گروه عمده آن شامل، پايگاهداده اوليه16 و پايگاههاي اطلاعاتي ثانويه17 ميباشد. برخي از پايگاهها و جايگاههاي اطلاعات پروتئيني که در اين تحقيق ازآنها استفاده شده، در ادامه به اختصار به آنها اشاره شدهاست.
1-1-2-1 جايگاه18 Expasy
Expasy 19 با آدرس دسترسي http://www.expasy.org جايگاه اينترنتي براي اطلاعات پروتئيني ميباشد که در آن اطلاعات کامل در مورد برخي از پروتئينها وجود دارد، بطوريکه محقيقين ميتوانند بدون هيچ محدوديتي به اطلاعاتي مانند پروتئوميکس، ژنوميکس، تکامل/ فيلوژني، سيستم بيولوژي، ژنتيکجمعيت و غيره دسترسي داشته باشند. در اين زمينه ميتوان سايتهاي ديگري را نيز نام برد مانند پايگاههايداده Swiss-prot,UniprotKB و Prosite که از طريق اين سايت قابل دسترسي ميباشند(Gasteiger et al., 2003).
2-1-2-1 پايگاهداده Swiss-Prot
آدرس جهاني دسترسي به اين بانک اطلاعاتي http:/expasy.org/sprot است. اين بانک اطلاعات مربوط به ساختمان اول پروتئينها را در خود ذخيره ميکند که در سال 1989 توسط Amos Boiroch و با همکاري بخش بيوشيمي پزشکي دانشگاه ژنو و مرکز تحقيقات بيولوژي ملکولي اروپا EMBL20 پايهگذاري شد. اين مجموعه در سال 1994 به انستيتو تحقيقات بيوانفورماتيک اروپا 21EBI منتقل گرديد و در آوريل 1998 به انستيتو بيوانفورماتيک پروتئين 22SIB3 انتقال يافت. اکنون اين بانک توسط سه موسسه EBI,EMBL و SIB نگهداري ميشود. نکته مهم در خصوص اين بانک توضيحات و شرح و بسط در رابطه با هر ورودي و غير تکراري بودن تواليها ميباشد. علاوه بر اين در سال 1996 بانکي از ترجمه EMBL بوجود آمدهاست و تحت عنوان TrEMBL نامگذاري شده و به Swiss-Prot اضافه گرديدهاست (Boutet et al., 2007, Bairoch et al., 2005).
در حال حاضر سه پايگاهداده Swiss-Prot، TrEMBL و 23PIR با هم تلفيق شده و پايگاهداده UniprotKB/Swiss-Prot ايجادشده که گستره بيشتري از هرکدام از پايگاههاي داده پيشين دارد (Schneider et al., 2009).
کيفيت طرحي که براي هر ورودي در Swiss-Prot نوشته ميشود آن را از ساير بانکهاي اطلاعاتي پروتئين مجزا ميکند و برخي از محققين اين بانک را مهتمرين بانک ساختار اول بشمار ميآورند. هر خط در اين بانک با يک رمز دو حرفي شروع ميشود و همچنين تمام وروديهاي بانک با رمز ” ID ” شروع و با يک علامت ” // ” پايان مييابند. 24ID، نام پروتئين را مشخص ميکند(O’Donovan C., 2002, Brigitte Boeckmann, 2003). تا تاريخ آوريل 2012 اين بانک شامل 535698 ورودي بودهاست که مرتبا در حال افزايش است بخشي از يک نمونه فايل Swiss-Prot مربوط به زير واحد اصلي پيلي CS3 (CstH) که در اين مطالعه از آنها استفاده شده در شکل 1-1 به نمايش درآمدهاست.

شکل1-1. بخشي از اطلاعاتي که از پايگاه داده Swiss-Prot براي زير واحد اصلي پيلي CS3 استخراج شدهاست.

3-1-2-1- پايگاهدادهProsite يا پايگاهداده موتيفها
موتيف در توالي پروتئيني، زيرتوالي حفاظت شده اي ميباشند که داراي يک عملکرد خاص بوده و به عنوان يک شاخص براي يک خانواده از پروتئينها تعريف ميشود. انواع اين تواليها در پايگاهداده پروسايت http://prosite.expasy.org قابل دسترسي است (Thilakaraj et al., 2007,Bairoch, 1992)
از طريق همرديفي چندتايي توالي پروتئينهاي نماينده از گونههاي مختلف الگوي توالي توافقي از مناطق حفاظت شده حاصل ميشود و اين تواليهاي حفظ شده به نام توالي موتيف، الگوي توالي توافقي يا امضاي توافقي خوانده ميشوند. وجود اين نوع موتيفها که شاخص يک خانواده هستند، کمک ميکنند تا در هنگام کشف يک پروتئين جديد نيز بتوان خانواده پروتئين را مشخص نمود، بنابراين عملکرد و ساختار پروتئين جديد بر اساس عملکرد پروتئينهاي هم خانودهاش مشخص ميشود با اين فرض که پروتئينهاي يک خانواده داراي يک جد مشترک ميباشند و در دوره تکاملي واگرا شده اند. در ضمن مواردي هم وجود دارد که توالي دو پروتئين تشابه زيادي دارند ولي هم خانواده نيستند بلکه براساس تکامل همگراي شباهت زيادي به هم پيدا کردهاند.
اين پايگاه داده همچنين داراي موتيفهاي اتصال به فلزات سنگين ميباشد که ID آنها PS50846، PS01047 و PS00154 ميباشد. با جستجوي پايگاههايداده توالي توسط اين موتيفها ميتوان پروتئينهاي دارنده موتيف را شناسايي و بر اساس اطلاعاتي که عمدتا بر مبناي مقالات گردآوري شداست، از آنها در تحقيقات زيستشناسي استفاده نمود. به عنوان مثال، باکتريها سازکارهاي مختلفي براي تحمل و جذب فلزات سنگين دارند که شامل سه سازکار: خارج کردن فلزات سنگين از طريق پروتئينهاي پمپاژ کننده فلزات به بيرون از سلولها، تجميع و کمپلکس کردن فلزات سنگين درون سلولها و نيز احيا يونهاي فلزات سنگين و تبديل به موادي با سميت پايين ميباشند(Nies , 1999). لذا بنظر ميرسد با جستجوي پايگاههايداده توالي با کمک توالي توافقي مربوط به فلزات سنگين، پروتئينهاي در ارتباط با فلزات سنگين را شناسايي و از آنها در تحقيقات استفاده نمود. در جدول (1-1) چند نمونه از موتيفهايي که در پروسايت براي فلزات سنگين وجود دارد نشان داده شدهاست و موتيفي که در اين تحقيق از آن استفاده شده د
ر رديف اول جدول (1-1) و با سايه زرد رنگ مشخص شدهاست.

جدول 1-1. موتيفهاي حفظ شده و اختصاصي متصل شونده به يونهاي فلزي
کد PDB
تعداد وروديها در UniProtKB
تعداد برخوردها که در جستجو با Scan prosite بدست آمدهاست
موتيف
نام ژن
يونهاي فلزي
2AJ1
87
276
[LIVNS] – x – {L} – [LIVMFA] – x – C – x – [STAGCDNH] [- C – x(3) – [LIVFG] – {LV} – x(2) – [LIV] – x(9,11) – [IVA] – x –